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小鼠瘦素(leptin)elisa试剂盒操作步骤-武汉赛培生物
发布时间:2022-09-16 16:26:34

  小鼠瘦素(leptin)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围:                                                           48T / 96T

25pg/ml -900 pg/ml

使用目的:

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中瘦素(leptin)含量

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本小鼠瘦素(leptin)水平。用纯化的小鼠瘦素(leptin)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入瘦素(leptin)再与HRP标记的瘦素(leptin)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后底物TMB显色。TMBHRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的瘦素(leptin)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品小鼠瘦素(leptin)浓度。

试剂盒组成

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1

1


封板膜

2片(48

2片(96


密封袋

1

1


酶标包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

标准品:1600pg/ml

0.5ml×1

0.5ml×1

2-8℃保存

标准品稀释液

1.5ml×1

1.5ml×1

2-8℃保存

酶标试剂

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

样品稀释液

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

显色剂A

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

显色剂B

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

终止液

3ml×1

6ml×1

2-8℃保存

浓缩洗涤液

20ml×20倍)×1

20ml×30倍)×1

2-8℃保存


样本处理及要求

1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBSPH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBSPH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。 

6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融

7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

操作步骤

1标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

800pg/ml

5号标准品

150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

400pg/ml

4号标准品

150μl5号标准品加入150μl标准品稀释液

200pg/ml

3号标准品

150μl4号标准品加入150μl标准品稀释液

100pg/ml

2号标准品

150μl3号标准品加入150μl标准品稀释液

50pg/ml

1号标准品

150μl2号标准品加入150μl标准品稀释液

 

2加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀

3温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟   

4配液:将30倍(48T20倍)浓缩洗涤液用蒸馏水30倍(48T20倍)稀释后备用

5洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外

7温育:操作同3

8洗涤:操作同5

9显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟.

10终止:每孔加终止50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)

11测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值) 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算

以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,    

在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD      

值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释      

倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标      

准曲线的直线回归方程式,将样品的OD      

代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释      

倍数,即为样品的实际浓度。 

 


注意事项

1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

2浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6.底物请避光保存。

7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9.本试剂不同批号组分不得混用。

保存条件及有效期:

1试剂盒保存:2-8

2.有效期:6个月

试剂盒性能:

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。

2.批内与批间应分别小于9%11%

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